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【集萃网观察】摘要:
纺织染料可染血细胞和骨髓中血细胞，有的可替代细胞化学染色，也有的可区分TH（CD4）细胞和TC/ TS细胞（CD）细胞。近年Kass又进行了禽类血细胞染色，并取得了满意结果，已引起国内检验界的高度重视。自从“纺织染料在血细胞形态学检验中的应用”一文在《中华检验医学杂志》发表后，陆续收到各地读者来信或电话，询问有关纺织染色有关技术问题，为了促使这一技术尽快在国内推广，同时为国产纺织染料扩大应用范围，现就国内外利用纺织染料染色血细胞技术问题综述如下。
1 标本制备
1. 1 纺织染料血细胞染色：所用的标本可采用末梢血涂片、骨髓涂片和外周静脉抗凝血浓集涂片等。
1. 2 静脉抗凝血浓集涂片：通常抽取患者外周静脉血于含有乙二胺四乙酸的抗凝管中，在室温静置2h，使红细胞自然沉降。用移液管从抗凝管中提取富含白细胞的血浆于离心管中，以2 500 r/ min离心5 min，移去上清液，剩下0. 1 mL富含白细胞和血小板浓集液。用浓集细胞制成浓集涂片，晾干。
2 固定液
固定是血细胞染色的重要步骤，纺织染料染色所用的固定液与传统的细胞化学染色方法所用固定液基本相同。Kass常用的有Bouin固定液（苦味酸饱和液75 mL，冰乙酸5 mL，37 %甲醛20 mL）、FAA固定液（这是纺织染料血细胞染色常用的固定液，由95 %乙醇90 mL，37 %甲醛5 mL和冰乙酸5mL配制而成，严格密封于室温下保存1年）、甲醇。另外，国内外有的将纺织染料的甲醇液或乙醇液直接加在涂片上，使固定和染色同步进行。
3 纺织染料
3. 1 国外纺织染料：碱性蓝122，C. I. basic blue122，basacryl blue X4GFL（BASF，Whippany，NJ）；碱性蓝141，C. I. basic blue 141，basacryl blueX7GFL（BASF，Whippany，NJ）；碱性蓝148，C. I.basic blue 148，Remacryl blue 4RL（Hoechst，Frankf urt）；碱性蓝54，C. I. basic blue 54，basacrylblue GF（BASF，Charlot te，NC）；碱性蓝41，C. I.basic blue 41，Remacryl blue BRL（Hoechst，Charlot te，NC）；碱性蓝75，C. I. basic blue 75，Ast razon blue 9GL（BASF，Charlot te，NC）；酸性红52，acid red 52（Int racide rhodamine B Cromptonand Kndwles，Charlot te，NC）；酸性红360，acid red360（Telon Fast Red AFG，Mobay Chemical Co，Pit t sburgh，PA）；酸性红137；Synacril黑；碱性蓝93。
3. 2 国内纺织染料：碱性品蓝Basic royol blue天津染化四厂；直接耐晒黑GBenzo fast black G河南安阳染料厂；碱性蓝Basic blue天津化工采购供应站；活性艳蓝KNR；活性艳蓝XBR；活性艳橙K27R；活性红棕KB3R；分散红3B；酸性枣红；酸性大红；还原桃红；活性艳紫X-2R；直接绿BE；士林绿FFB；硫化青BR；碱性橙；酸性橙。
4 染色液
显色是血细胞染色的关键步骤，染色结果的成败与染色液紧密相关。
4. 1 纺织染料水溶液：Kass所用可溶于水的纺织染料有碱性蓝141、碱性蓝93、碱性蓝54、碱性蓝148、酸性红52、酸性红137、Synacril黑等。将这些纺织染料配制成一定浓度的水溶液，室温下至少稳定1年。①碱性蓝54水溶液，300 mg染料溶于10mL蒸馏水中。②1 %碱性蓝141水溶液，置于有盖塑料瓶中。③2. 5 %碱性蓝141水溶液，经2 000 r/min离心10 min，取上清置于磨口瓶中。④10 %碱性蓝141水溶液。⑤碱性蓝148水溶液，5 g碱性蓝148染料溶于100 mL去离子水中。置于有盖玻璃瓶中。⑥1 %酸性红52水溶液，置于有盖塑料瓶中。⑦10 g/ L碱性品蓝水溶液，朱芸等用碱性品蓝的水溶液进行染色。
4. 2 纺织染料缓冲溶液：Kass还将纺织染料碱性蓝75、碱性蓝141配成纺织染料碱性缓冲液，将碱性蓝41配成磷酸盐缓冲液，郝冀洪等将碱性品蓝配成N-（2-羟乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（N-2-hydroxyet hylpiterazine-N’-2-ethanesulfonic acid，HEPES）溶液。
4. 2. 1 碱性蓝75碱性缓冲液：首先将400 mg碱性蓝75染料溶于7 mL蒸馏水中，搅动使染料溶解，然后加入p H 7. 6的Trizma maleat缓冲液4 mL，搅动10 s，在临用前配制成工作液，室温可稳定24 h。染液配制的顺序非常关键，否则影响染色结果。
4. 2. 2 碱性蓝141碱性缓冲液：10 %碱性蓝141水溶液加入等量p H 7. 6的Trizma maleat缓冲液中，使用前配制，室温可稳定2 h。
4. 2. 3 p H 7. 6的Trizma maleat缓冲液：将Trizmamaleat 47. 44 g置于圆形量筒内，加950 mL蒸馏水，然后置一大烧杯中，滴加浓NaOH并不断搅动使p H为7. 6，最后加蒸馏水至1 L。
4. 2. 4 1 %碱性蓝41磷酸盐缓冲液染液：1 g碱性蓝41染料溶于p H 6. 8磷酸盐缓冲液中（Na2 HPO4•7 H2O 8. 9 g和KH2 PO4 4. 6 g溶于1 L蒸馏水中，调p H至6. 8）。
4. 2. 5 1 g / L碱性品蓝HEPES染液：首先配制1g/ L HEPES p H 7. 0溶液，再将碱性品蓝溶于HEPES溶液中，配成碱性品蓝HEPES染液。
4. 3 纺织染料甲醇溶液：Kass将纺织染料碱性蓝41、碱性蓝54、碱性蓝122、碱性蓝141、酸性红360等直接溶于甲醇中，配成一定浓度的纺织染料甲醇染液，室温可稳定1年。
碱性蓝54甲醇染液。碱性蓝122甲醇染液，10 %碱性蓝122甲醇溶液。碱性蓝141甲醇染液，5 %的碱性蓝141甲醇溶液经2 000 r/ min离心10min，取上清置于磨口瓶中。1 %碱性蓝360甲醇染液。碱性蓝甲醇染液，王彩云等将国产纺织染料碱性蓝直接溶于甲醇中。
4. 4 纺织染料乙醇溶液：①1 g/ L耐晒黑G乙醇染液，李顺义等将国产纺织染料耐晒黑G直接溶于乙醇中，配成1 g/ L耐晒黑G乙醇染液，室温可稳定1年。②10 g/ L碱性品蓝乙醇染液，郝冀洪等将国产纺织染料碱性品蓝直接溶于乙醇中，配成10g/ L碱性品蓝乙醇染液，4℃可稳定1年。
4. 5 纺织染料的混合染液：Kass将1 %碱性蓝41磷酸盐缓冲液染液5 mL、1 %碱性蓝141水溶液5mL和1 %酸性红52水溶液5 mL配成混合染液。
5 漂洗液
漂洗是纺织染料染色的特殊步骤，也是与传统的血细胞染色方法主要的区别之处。Kass所用漂洗液主要有以下几种，甘氨酸-NaCl-NaOH p H8. 45缓冲液。Ⅰ液，将NaCl 5. 856 g溶于50 mL蒸馏水中，加入甘氨酸7. 507 g溶解后加蒸馏水至1L。Ⅱ液，将NaOH 4 g溶于50 mL蒸馏水中，移入1 L容量瓶，加蒸馏水至1 L。取Ⅰ液95 mL加入Ⅱ液5 mL并调至p H 8. 45。加几滴石炭酸防腐，可在5℃冰箱保存数月。
醋酸钠缓冲液（p H 3. 4）。将醋酸钠27. 22 g溶于400 mL蒸馏水中，加冰醋酸并不停搅动，使p H至3. 45，移入1 L容量瓶，加蒸馏水至1 L。
磷酸盐缓冲液（p H 5. 6）。Ⅰ液，Na2 HPO49. 465 g溶于500 mL蒸馏水中，移入1 L容量瓶，加蒸馏水至1 L。Ⅱ液，KH2 PO4 9. 07 g溶于500mL蒸馏水中，移入1 L容量瓶，加蒸馏水至1 L。于Ⅱ液95 mL中加入Ⅰ液5 mL，5℃稳定6个月。
醋酸钠-醋酸缓冲液（p H 3. 6）。Ⅰ液，0. 1 mol/L冰醋酸溶液。在1 L容量瓶中加冰醋酸5. 7 mL，加蒸馏水至1 L。Ⅱ液，0. 1 mol/ L醋酸钠溶液。将醋酸钠13. 6 g溶解后移入1 L容量瓶，加蒸馏水至1 L。Ⅰ液185 mL加Ⅱ液15 mL充分混匀。
HEPES多离子缓冲液（p H 7. 0）。溶解下列成分于1 L蒸馏水中作为100 %浓缩液。乙酸镉3. 6mg、氯化锰2. 3 mg、乙酸钾251 mg、三氯化铁500mg、氯化钙33 g、氯化钠17. 8 g、HEPES 11. 9 g。1L浓缩液加10滴液体石炭酸作防腐剂，5℃可稳定1年。实验中用1∶100蒸馏水稀释后进行漂洗。
国内建立的纺织染料血细胞染色法均无漂洗过程。
6 染色方法
6. 1 单染
6. 1. 1 以固定液固定后的涂片直接加纺织染料水溶液染色
6. 1. 1. 1 粒细胞染色法：FAA固定涂片5 min，碱性蓝93染色的水溶液染色。
6. 1. 1. 2 粒细胞染色法：Bouin固定液固定涂片5min后，用酸性红52水溶液染色。
6. 1. 1. 3 单核细胞染色法：FAA固定涂片5 min，用蒸馏水漂洗10 s，晾干，碱性蓝54水溶液染色10min，倒去多余的染液，在醋酸钠-醋酸缓冲液p H3. 6中漂洗2 s，晾干。
6. 1. 1. 4 TH细胞染色法：FAA固定涂片5 min，用蒸馏水漂洗15 s，晾干，碱性蓝148水溶液染色1min，磷酸盐缓冲液p H 5. 6中漂洗2 s，晾干。染液染色3 min，用于离心的细胞群。
6. 1. 1. 5 巨核细胞质/组织嗜碱细胞颗粒/嗜酸粒细胞颗粒染色法：甲醇固定涂片5 min，Synacril黑AN水溶液染色10 min。
6. 1. 1. 6 全血细胞染色法：甲醇固定涂片2 min，水洗，碱性品蓝的水溶液染色10 min，水洗，干后镜检。
6. 1. 2 以固定液固定后的涂片加纺织染料碱性水溶液染色：幼稚红细胞染色法，FAA固定涂片5min，用蒸馏水漂洗15 s，晾干，用碱性蓝75碱性缓冲液染色10 min，倒去染液，在甘氨酸-NaCl-NaOHp H 8. 45缓冲液中漂洗2 s，晾干。中性粒细胞染色法，FAA固定涂片5 min，碱性蓝141碱性缓冲液染色。
6. 1. 3 纺织染料乙醇溶液直接染色：粒细胞染色法，涂片置培养皿中，加1 %耐晒黑G乙醇溶液加盖，置37℃水浴箱15 min，水洗数次，蒸馏水洗3次，待干，以中性红液复染30 s，水洗。
6. 1. 4 纺织染料甲醇溶液固定并染色：嗜碱粒细胞/嗜酸粒细胞颗粒染色法，碱性蓝41甲醇溶液固定并染色。组织嗜碱细胞/嗜碱细胞染色法，碱性蓝甲醇溶液染色15 min，水洗。
6. 2 双染
6. 2. 1 TH细胞（辅助性T淋巴细胞）和TC/ TS细胞鉴别染色法：碱性蓝141甲醇染液1mL染色5min后加碱性蓝141碱性缓冲溶液1 mL染色10min，倒去多余的染液，在HEPES p H 7. 0多离子缓冲液中漂洗10～15 s。
6. 2. 2 单核细胞染色法：碱性蓝54甲醇液染色5min后，加碱性蓝141碱性缓冲液染色10 min，磷酸盐缓冲液p H 5. 6漂洗5 s。
6. 2. 3 嗜酸粒细胞染色法：碱性蓝122甲醇液染色5 min后，加碱性蓝141碱性水溶液，使两种溶液充分混合，10 min后，醋酸钠缓冲液p H 3. 4漂洗5s。
6. 2. 4 巨核细胞染色法：碱性品蓝乙醇染液0. 5mL，染色5 min后再滴加等量碱性品蓝HEPES染液，充分混匀染色10 min。流水冲洗2 min，晾干。
6. 2. 5 禽类白细胞染色法：酸性红360甲醇液染色1 min，1 %碱性蓝41磷酸盐缓冲液p H 6. 8染液、1 %碱性蓝141水溶液和1 %酸性红52水溶液各5mL配成混合染液中染色5 min，磷酸盐缓冲液p H5. 6漂洗10 s。
近年来，血液学检验技术的飞速发展及血液分析仪在全国各级医院的普及使用，大大提高了临床血液学检验的质量和效率，使临床血液学检验进入了一个新的阶段。血涂片形态学检验作为临床检验学的一项简便、快捷的诊断方法，在血液病及血液感染性疾病的检验中起着重要的作用。纺织染料染色方法简单，染料便宜，染色结果稳定特异，不需特殊的仪器设备，易于在各级医疗单位推广应用。我国是纺织大国，国产纺织染料众多，有些国产纺织染料有一定特色，利用国产纺织染料进行血细胞染色，既拓宽了国产纺织染料的应用范围，也可摸索出一些新的染色方法，具有良好的社会效益和经济效益，发展前景广阔。
文章来源：化工资讯 作者：郝冀洪，任贵云，李顺义
